随着工业化与农业集约化发展，重金属、抗生素、持久性有机污染物等不断进入环境，通过食物链富集、微生物群落结构改变、功能基因水平转移等途径，对生态系统稳定性及人类健康构成潜在威胁。生态风险评估作为环境管理的核心环节，需精准识别污染物暴露水平与生态效应的关联，而传统监测方法（如微生物培养法、化学仪器分析法）存在明显局限：培养法仅能检测可培养微生物，无法反映群落真实功能；化学法虽能定量污染物总量，但难以评估其生物有效性及对微生物代谢功能的影响。

荧光定量PCR（qPCR）技术通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号，实现目标核酸的定量分析，具有灵敏度高、特异性强、检测周期短等优势。博清生物科技（南京）有限公司作为国内分子诊断设备领军企业，其研发的荧光定量PCR仪优化了光学系统与温控模块，支持5通道同时检测，可满足多靶点同步分析需求，且具备智能化操作界面与数据溯源功能，适合环境样品的高通量检测。

一、材料与方法

（一）研究区域与样品采集

选取3类典型研究区域：

1、工业污染区（IP）：某化工园区废水排放口下游0-1000m水体及周边500m农田土壤；

2、农业种植区（AG）：长期施用化肥（N-P-K复合肥）与抗生素类农药（如四环素类）的农田土壤；

3、对照区（CK）：远离污染源的自然保护区水体与土壤。

样品采集方法参照《环境监测技术规范》：

1、水样：采用有机玻璃采水器采集表层（0.5m）、中层（2m）、底层（4m）水样，混合后取1L，经0.22μm 聚醚砜滤膜过滤，滤膜置于-20℃保存；

2、土壤样：采用五点采样法采集0-20cm表层土壤，每点取100g，混合后过2mm筛，去除杂质，分装备用（-20℃保存）。每个区域设3个重复采样点，共采集样品36份（水体18份、土壤18份）。

（二）仪器与试剂

1、核心仪器：博清生物荧光定量PCR仪；

2、辅助仪器：高速冷冻离心机、超纯水仪、核酸提取仪；

3、试剂：土壤/水体微生物DNA提取试剂盒、TaqMan探针qPCR预混液、目标基因特异性引物探针、标准品质粒。

（三）实验方法

1、样品前处理与DNA提取

水样：将冷冻保存的滤膜剪碎，加入裂解液，参照DNA提取试剂盒说明书进行微生物总DNA提取；

土壤样：称取0.5g土壤样品，去除腐殖质后，采用核酸提取仪自动化提取总DNA。提取的DNA检测纯度，琼脂糖凝胶电泳验证完整性，-80℃保存备用。

2、qPCR反应体系与程序设置

基于博清生物荧光定量PCR仪，构建20μL qPCR反应体系：10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，探针0.4μL，DNA模板2μL，无酶水6μL。空白对照以无酶水替代模板，每个样品设3次技术重复。

反应程序：预变性95℃ 3min；变性95℃ 10s，退火延伸60℃ 30s（采集荧光信号），40个循环；溶解曲线分析（60-95℃，升温速率0.5℃/s）。

3、标准曲线构建与仪器性能验证

将梯度稀释的标准品质粒进行qPCR检测，以标准品浓度的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，构建标准曲线，计算线性相关系数（R²）与扩增效率。

验证博清生物荧光定量PCR仪的灵敏度（最低检测限）、重复性（批内、批间Ct值变异系数，CV）与特异性（溶解曲线单峰，无非特异性扩增）。

二、结果与分析

（一）博清生物荧光定量PCR仪性能验证结果

1、标准曲线与扩增效率

3种目标基因的标准曲线均呈现良好线性关系：cadA基因 R²=0.998，E=98.2%；tetA基因 R²=0.997，E=96.5%；amoA基因R²=0.999，E=101.3%。扩增效率均处于90%-110% 的理想范围，表明仪器定量准确性满足环境样品检测需求。

2、灵敏度与重复性

博清生物荧光定量PCR仪对3种基因的最低检测限均达10拷贝/μL，且当模板浓度为10拷贝/μL时，Ct值变异系数<3%（n=3），表明仪器具备高灵敏度。批内重复性试验中，同一样品3次重复的Ct值CV为1.2%-1.8%；批间重复性试验（连续3天检测）的Ct值CV为1.5%-2.0%，均<2%，证实仪器检测稳定性优异。

3、特异性

溶解曲线分析显示，3种目标基因均呈现单一峰值，无引物二聚体或非特异性扩增峰，表明引物探针设计合理，仪器光学系统可精准区分不同荧光信号，特异性良好。

（二）不同区域目标基因丰度分布

1、水体样品

工业污染区（IP）水体中cadA基因与tetA基因丰度显著高于对照区（CK）：IP区cadA基因丰度为（2.47×10⁶±1.23×10⁵）拷贝/L，是CK区（3.00×10⁴±2.15×10³）的82.3倍；tetA基因丰度为（1.97×10⁶±1.05×10⁵）拷贝/L，是CK区（3.00×10⁴±1.87×10³）的65.7倍（P<0.01）。农业种植区（AG）水体中tetA基因丰度为（4.50×10⁵±2.31×10⁴）拷贝/L，是CK区的15.0倍（P<0.05），cadA基因丰度与CK区无显著差异（P>0.05）。

2、土壤样品

IP区土壤中amoA基因丰度为（1.26×10⁵±8.50×10³）拷贝/g，仅为CK区（4.00×10⁵±2.50×10⁴）的31.5%（P<0.01），表明工业污染抑制硝化细菌活性；AG区土壤中tetA基因丰度为（8.40×10⁵±4.20×10⁴）拷贝/g，是CK区（6.00×10⁴±3.10×10³）的14.0倍（P<0.01），amoA基因丰度为（2.80×10⁵±1.50×10⁴）拷贝/g，显著低于CK区（P<0.05）。

（三）生态风险评估结果

基于ERI模型计算，不同区域生态风险等级差异显著：

1、IP区：水体ERI=0.87，土壤ERI=0.82，均为高风险，主要风险源于重金属与抗生素复合污染导致的抗性基因富集及功能微生物抑制；

2、AG区：土壤ERI=0.52，为中风险，风险贡献以tetA基因为主（化肥农药施用导致抗生素抗性基因扩散）；水体ERI=0.28，为低风险；

3、CK区：水体与土壤ERI均<0.3，为低风险，生态系统功能稳定。

三、讨论

（一）博清生物荧光定量PCR仪在环境监测中的技术优势

相较于传统检测技术，博清生物荧光定量PCR仪在环境样品分析中展现三大核心优势：

1、高灵敏度与定量精度：最低检测限达10拷贝/μL，可捕获环境中低丰度抗性基因与功能基因，解决传统培养法“漏检”问题；标准曲线R²>0.995，确保基因丰度定量准确，为生态风险评估提供可靠数据基础；

2、高效性与高通量：支持96孔板与 5通道同步检测，单批样品（36份）检测周期仅需2.5h，较普通PCR（需后续电泳定量）效率提升3-4倍，适合大规模环境普查；

3、智能化与易用性：配备LIMS数据管理系统，可自动生成标准曲线、计算基因丰度及导出报告，减少人为操作误差；触摸屏操作界面简化流程，降低非专业人员使用门槛，便于在基层环境监测站推广。

（二）生态风险评估结果的环境意义

工业污染区高ERI值表明，重金属（如镉）与抗生素（如四环素）的复合暴露可显著促进抗性基因的水平转移，而amoA基因丰度降低则意味着硝化作用减弱，可能导致土壤氮循环失衡，进而影响植物生长与水体富营养化进程。农业种植区tetA基因富集提示，抗生素类农药的不合理使用可能成为抗性基因进入环境的重要途径，需加强农药使用管控。

（三）研究局限性与未来方向

本研究仅选取3类目标基因，未来可结合宏基因组学技术，利用博清生物荧光定量PCR仪的多通道优势，同步检测更多污染物指示基因，构建更全面的生态风险评估体系；此外，可开展长期动态监测，分析基因丰度变化与生态效应的时间关联，提升风险预测能力。

博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪具备高灵敏度、高重复性与高特异性，可高效、准确定量环境中的抗性基因与功能基因，满足环境监测对分子标志物检测的技术需求。

基于该仪器的检测数据构建的ERI模型，可有效量化工业污染区、农业种植区的生态风险等级，明确污染来源与风险贡献因子。

博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪为环境监测与生态风险评估提供了可靠的分子生物学工具，建议在环境管理与科研领域进一步推广应用，为生态系统保护与污染防控提供技术支撑。